Nei primi mesi del 1940 fu impiegato per sperimentare il rilascio di Siluri a Lenta Corsa da un sommergibile: sulla coperta furono sistemati dei supporti su cui furono posti tre dei mezzi assicurati con cavi. L'Ametista s'immerse poi nella rada di La Spezia e rilasciò i tre SLC che raggiunsero e minarono il vecchio esploratore Quarto.

Allo scoppio della guerra fu dislocato in agguato nelle acque dell’Egitto settentrionale: non avendo rilevato  traffico nemico, il 15 giugno 1940 rientrò alla base. Fino all’8 settembre 1943 l’Ametista effettuò 27 missioni di guerra percorrendo 18.865 miglia. Subito dopo l’armistizio il sommergibile, al comando del S.T.V. Ginocchio si diresse ad Ancona e seguì le vicende del Serpente. Anch’esso si auto-affondò al largo di Ancona. Il Comandante Ginocchio entrò a far parte della Marina della Repubblica di Salò, come il Comandante Allegri. Alla fine della guerra fu sottoposto a giudizio per il reato di - perdita di nave -, ma il procedimento si concluse favorevolmente per Ginocchio, che venne prosciolto.